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摘要：
基于mRNA的药物，尤其是mRNA疫苗，已被广泛证明是一种富有前景的免疫治疗手段。mRNA疫苗具有高效、低副反应和获取成本低等显著优势，使其在各种传染病和癌症临床前和临床试验中广泛应用。技术进步使得原本阻碍mRNA疫苗开发的问题进一步缓解，例如基因翻译和体内递送中存在的低效率问题。技术升级还可以大大改善mRNA的免疫原性。本综述，我们总结了有关mRNA疫苗优化的详细信息，以及这种疫苗形式的潜在生物学机制。介绍了mRNA疫苗在某些传染病和癌症中的应用，以及在由细菌病原引起的疾病（如结核病）中的应用前景。同时，针对未来mRNA疫苗开发提出一些建议，涉及储存，安全性和个性化疫苗合成几个方面。
1.引言
mRNA是一种中间遗传物质，最早由Brenner等人于年发现。然而，直到年Malone等人才提出基于mRNA的药物的构想并证明了在阳离子脂质体（N-[1-（2,3-二环氧乙烷氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵（DOTMA））的包裹下，mRNA可以成功转染多种真核细胞并表达。年，通过直接注射，体外转录的mRNA在小鼠骨骼肌细胞中充分表达，这是首次体内成功表达mRNA，从而证明了mRNA疫苗开发的可行性。从那时起，mRNA结构研究和其他相关技术得到了迅速发展。在这种情况下，由于mRNA的不稳定性，高天然免疫原性和体内递送效率低下而产生的一些发展限制逐步得到缓解，现在mRNA疫苗已在各种疾病中得到了广泛研究（图1）。
图1基于mrna的药物技术开发中的一些关键发现和进展的时间表。绿框代表mRNA机制的发现和进展;蓝框代表基于mrna的药物应用的发现和进展。缩写:mRNA,messengerRNA;5cap，5帽;LNP,纳米脂质体粒子;COVID-19,冠状病毒病;DCs,树突细胞。mRNA疫苗已显示出常规疫苗所没有的许多独特优势。首先，mRNA理论上可以满足所有遗传信息的要求，以编码和表达各种蛋白质。可以通过修饰mRNA序列来优化疫苗开发效率，与其他类型的疫苗修饰方法相比，这是一种更方便的方法。此外，尽管编码的抗原不同，但大多数mRNA疫苗的生产和纯化过程非常相似，因此开发其他相似的mRNA疫苗有可能被标准化，利用体外转录也使mRNA疫苗的生产更加容易。显然，mRNA疫苗可以节省时间和成本。其次，mRNA具有自我佐剂特性，可通过肿瘤坏死因子-α（TNF-α），干扰素-α（IFN-α）和免疫细胞分泌的其他细胞因子来激活强而持久的适应性免疫反应。而多肽和蛋白质疫苗则需要额外佐剂才能达到类似目标。mRNA的体内表达还可以避免蛋白质和病毒来源的污染。通过修饰mRNA序列和递送系统，可以有效调节mRNA的表达活性和体内半衰期。第三，与基于DNA的疫苗相比，mRNA疫苗可以在不进入细胞核的情况下更有效地表达靶蛋白，因为它们在细胞质中表达。另外，由于mRNA序列的化学组成不同于DNA，并且缺少CpG岛，因此mRNA整合入宿主DNA基因组并诱导免疫排斥反应的可能性较低。此外，mRNA仅具有瞬时活性，因此很容易通过生理代谢途径完全分解，不会对宿主体内稳态造成负担。
第一家基于mRNA药物研发的公司成立于年，此后大量公司开始研发基于mrna的药物。目前已有20余种以mrna为基础的候选药物进入临床试验。mRNA疫苗领域的市场也有所增长，高达数百亿美元，这意味着基于mRNA的药物，特别是mRNA疫苗的开发具有广阔的前景。特别是，mRNA疫苗在快速应对新出现的流行病方面具有巨大潜力，如冠状病毒病(COVID-19)的全球爆发，将激发全球科学家更多的兴趣和研究预期。
2.mRNA的体外合成与修饰
迄今为止，mRNA的体外转录技术已经成熟，最流行的方法是使用T3，T7或SP6RNA聚合酶和线性DNA（线性化质粒DNA或通过PCR制备的合成DNA）进行mRNA合成。真核细胞中mRNA成熟需要一些基本结构元件，包括5’加帽（5’cap），5’非翻译区（5’UTR），开放阅读框（ORF）区，3’非翻译区（3’UTR）和poly（A）尾部结构。mRNA保持完整结构有利于其稳定性和表达能力。基于完整结构修饰的mRNA序列可以进一步优化mRNA疫苗的效率。然而，mRNA体外转录的初始产物是靶标mRNA，非靶标RNA，核苷酸，寡脱氧核苷酸和蛋白质的混合物。为了纯化mRNA，用沉淀和提取去除常见杂质，用色谱技术将目标mRNA与其他mRNA杂质分离。
2.15’加帽及修饰
真核和部分病毒基因组的mRNA在mRNA序列的5’末端有一个7-甲基鸟苷（m7G）帽，在mRNA体外转录过程中，它通过5’、5’-三磷酸桥（ppp）连接到第一个RNA核苷酸。5’cap可以消除mRNA序列中的游离磷酸基团，从而显著增强mRNA的稳定性，进而使核糖体通过结合真核翻译起始因子4E（eIF4E）来识别mRNA的起始并提高翻译效率。因此，很明显5’cap修饰对提高mRNA性能至关重要。体外mRNA加帽有两种常用方法，第一种是在mRNA转录系统中添加一个规则的m7GpppG帽类似物结构来实现mRNA加帽及体外转录。第二是在体外转录初期，通过加帽酶反应完成mRNA加帽。
用帽类似物加帽是mRNA体外转录中最常见的方法，但研究发现常规帽类似物可逆向结合mRNA序列，在这种情况下，会形成mRNA异构体，导致mRNA下游翻译效率低下。为了避免5’cap的反向引入，已开发了抗反向帽类似物（ARCA）。ARCA在C2或C3位置进行修饰，以确保甲基在转录过程中与正确位置的羟基反应。与常规帽类似物相比，ARCA加帽的mRNA具有更高的翻译效率。近年来，已开发出对ARCA结构的进一步修饰以改善mRNA特性，例如，基于ARCA修饰的硫代磷酸酯通过增加其对真核翻译起始因子4E（eIF4E）的亲和力来提高mRNA的翻译效率，并通过降低去帽酶的敏感性从而提高mRNA稳定性。Kuhn等研究表明，m27,2’-OGppSpG（β-S-ARCA）可以显著提高未成熟树突状细胞（DC）中mRNA的稳定性和翻译效率。年，Strenkowska等人合成了由1，2-二硫代二磷酸、ARCA和一条延伸的多磷酸链组成的合成帽类似物，称为“2S类似物”，其功能优于临床试验中使用的任何S-ARCA。另一个帽类似物，是年研发的共转录加帽法称为“CleanCap”，它由初始的加帽三聚体产生天然存在的5’cap结构，从而将加帽效率提高到将近90-99％。
2.2非翻译区优化（UTRs）
UTR是位于mRNA编码区上游（5’UTR）和下游（3’UTR）域的mRNA序列的非编码部分。据报道，UTR与mRNA复制和翻译过程有关，可以通过与RNA结合蛋白的反应极大地改变mRNA的降解和翻译效率。为了增强mRNA的稳定性和翻译效率，UTR的优化是必要的。
一般而言，UTR优化是为了提高体内mRNA表达水平。例如，广泛应用的3’UTR序列来自于包含翻译和稳定性调控元件的α-球蛋白和β-球蛋白。通常认为3’UTR是mRNA中不稳定因子较集中的区域，因此在合成3’UTR时避免不稳定序列可以增加mRNA的稳定性，例如富含AU的序列和富含GU的序列。另一方面，将稳定的元素引入3’UTR也可以显着提高mRNA的稳定性并延长其半衰期。Niessen等发现在3’UTR引入两个随机稳定元件成功地提高了mRNA的翻译效率。5’UTR直接影响其下游序列ORF的翻译，因此对5’UTR的优化不应影响ORF的正常翻译过程。避免5’UTR的基因序列与ORF的上游相同，可以有效地防止mRNA翻译过程中错误的启动和阅读框的替换。另外，可以将某些特定序列添加到5’UTR中以增强mRNA的稳定性和翻译的准确性。例如，Kozak等在该区域中插入序列GCC-（A/G）-CCAUGG，使得翻译过程的开始更准确。研究还表明，5’UTR的二级结构过度稳定会阻碍核糖体与mRNA的结合，而短而松散的5’UTR更有利于mRNA的翻译过程。
2.3开放阅读框（ORF）的密码子优化
作为mRNA的编码区，ORF区的可翻译速率至关重要。因此，在该区域中选择合适的密码子可以优化mRNA的整体翻译效率。优化的ORF序列通常包含同义的频繁密码子和/或tRNA丰度更高的密码子，以取代ORF中的稀有密码子，使得高度表达的基因可以使用与宿主相同密码子来翻译，和/或在表达外源mRNA时确保tRNA的丰度。但是，mRNA的高翻译率并非全部都是有益的，因为某些蛋白质需要低的翻译率才能正确、稳定和有效地折叠。在这种情况下，在ORF中使用低频密码子可以产生更高质量的蛋白质产品。因此，对于不同的抗原，应使用不同的密码子优化策略来提高mRNA的翻译率，并同时确保表达的抗原质量。
2.4Poly（A）尾巴和mRNA的稳定性
Poly（A）尾巴和5’Cap结构都是mRNA翻译过程中的关键要素。Poly（A）序列可以减慢RNA核酸外切酶的降解过程，从而增加稳定性，延长体内半衰期并提高mRNA的翻译效率。此外，Poly（A）结合蛋白（PABP）可以通过翻译起始因子（例如eIF4G和eIF4E）与5’Cap连接，进而影响mRNA的闭环结构并协同调节mRNA的稳定性和翻译效率。但是，PABP也可以与腺苷酸复合物结合并参与由microRNA介导的翻译抑制过程。PABP的矛盾功能表明，不同Poly（A）序列长度可以不同地影响mRNA翻译效率。有多种合成Poly（A）结构的方法，其中，利用具有Poly（A）结构信息的DNA模板进行体外转录可以产生确定的Poly（A）序列。用重组Poly（A）聚合酶添加Poly（A）是通过在mRNA转录后进行酶促多腺苷酸化，进而得到不同长度的聚（A）结构混合物。早期研究表明，较长的Poly（A）序列可以改善mRNA的稳定性。例如，DC中Poly（A）序列的最佳长度大约在-个核苷酸之间，而人类原代T细胞中Poly（A）序列长度的多个核苷酸可以更有利于增加mRNA稳定性和翻译效率。当Poly（A）序列长度小于20个核苷酸时，它将降低mRNA的翻译效率。然而，在年，Lima等通过新的全基因组研究技术发现，具有高翻译效率的mRNA通常具有短的Poly（A）序列，在高翻译的真核mRNA中通常会发现短的Poly（A）结构。因此，以上表明，由于在各种类型的细胞中高翻译效率mRNA所需的Poly（A）序列的长度是不同的，因此应该进行调整以优化mRNA的翻译效率。
3.mRNA的免疫原性调节
基于其自身佐剂功效，当mRNA作为外源基因的载体时，它可以表现出与mRNA病毒相似的某些特性。在这种情况下，mRNA可以被抗原呈递细胞（APC）识别，随后会激活模式识别受体（PRR），例如Toll样受体3（TLR3），TLR7和TLR8[30,53,54]。双链RNA（dsRNA）可以与细胞质中维甲酸诱导型基因I（RIG-1）样受体（RLR）结合，例如RIG-1和分化相关黑色素瘤5（MDA5），促进APC的成熟、促炎性细胞因子的分泌和I型干扰素（IFN）的分泌。最终，这会导致强烈的抗原特异性体液和细胞免疫反应（图2）。但是，由肽或蛋白质组成的亚单位疫苗通常无法激活PRR，因此有必要添加佐剂，这些佐剂可以启动和支持适应性免疫反应，从而使人体对亚单位疫苗的免疫反应达到理想结果。因此，mRNA强大的适应性免疫反应和自我佐剂特性使mRNA在作为疫苗使用中显示出巨大优势。单链RNA（ssRNA）可以在体内mRNA传播过程中通过TLR7和TLR8识别来触发DC的抗病毒激活状态。dsRNA污染物还可通过TLR3识别触发免疫激活。但是，细胞质中mRNA刺激的免疫反应会刺激细胞分泌大量I型和其他干扰素，这些干扰素会抑制mRNA的翻译并最终导致翻译停滞，RNA降解，CD8（分化簇8）+T细胞激活减少，最终免疫反应终止。这可能会对某些mRNA应用产生负面影响，例如疫苗和蛋白质替代疗法。mRNA的自佐剂性质在mRNA疫苗的应用中既有优势也有劣势，因此，有必要根据不同的医学需求形成mRNA的免疫原性调控，从而有效地提高mRNA疫苗的应用效率。
图2mRNA体外转录和先天免疫激活3.1mRNA纯化可调节自佐剂功能
mRNA体外转录产物往往含有dsRNA污染物。dsRNA是RNA病毒基因组复制中间体，可促进I型IFN的产生。因此，纯化mRNA体外合成产物可有效降低mRNA疫苗的I型IFN免疫应答，提高mRNA翻译效率。研究表明，色谱法(快速蛋白液相色谱、高效液相色谱等)可以有效去除mRNA产物中的dsRNA，纯化后原代细胞的mRNA翻译水平可提高10-倍，细胞因子分泌水平仍保持较高水平。
3.2优化mRNA序列调控自身佐剂特性
ssRNA还可以作为有效的病原相关分子模型（PAMP），引起强烈的免疫反应并刺激I型IFN的产生。I型IFN可诱导多种类型的IFN刺激基因(ISGs)抑制mRNA翻译。例如，IFN诱导的具有四重重复序列的蛋白(IFIT)可与5’Cap结构结合或与eIF3相互作用破坏mRNA翻译过程。因此，优化mRNA序列可以调控mRNA疫苗激活免疫应答的能力。
PRR可以识别Cap0（m7GpppN）封闭或未封闭的mRNA，并抑制其翻译。年，Kumar等评估了PRR识别三种形式的带帽mRNA的能力，包括Cap0帽，Cap1（m7GpppNmN）帽和无帽mRNA，发现Cap1帽的mRNA在被PRR识别后仍然可以翻译，而Cap0帽的和未帽的mRNA却不能。因此，选择合适的5’Cap结构可以避免过度的免疫反应。
ORF区域修饰还可以减少由PRRs识别引起的强烈免疫反应，并提高mRNA的翻译水平。在年，Anderson等研究了未修饰的mRNA和假尿苷修饰的mRNA之间的差异，评估了mRNA被2’-5’-寡腺苷酸合成酶（OAS蛋白，由I型IFN诱导）识别的能力和mRNA的稳定性，结果表明，经伪尿苷修饰的mRNA在OAS激活方面效率较低，RNA降解率更低，mRNA翻译效率更高。Karikó等发现静脉内注射假尿苷修饰的mRNA，与未修饰的mRNA相比，发现脾脏中的靶蛋白表达较高，血清中的IFN-α浓度较低。尿嘧啶类似物是用于mRNA修饰的最常见类似物，一些其他碱基类似物也可用于mRNA序列修饰。Kormann等使用不同比例的5-甲基胞苷和2-硫尿苷来修饰mRNA序列，从而有效降低了PRR的识别率并提高了mRNA的细胞内稳定性
3.3添加佐剂以优化mRNA免疫原性
一些研究需要增强mRNA疫苗的免疫原性，需在mRNA疫苗系统中添加佐剂才能满足这一需求。用传统的佐剂MF59（诺华公司）和阳离子纳米乳剂（CNE）配制RNA疫苗，可在不同动物模型显示增强疫苗免疫原性和功效。某些免疫调节分子也具有佐剂活性。TriMix是由布鲁塞尔自由大学开发的一种新的佐剂，由编码三种免疫激活蛋白的CD3，CD70配体（CD40L）和具有持续活性的TLR4组成。TriMixmRNA可以增加裸露的、未修饰的、未纯化的mRNA的免疫原性，并且还与DC的成熟和细胞毒性T淋巴细胞反应的增强有关。在年，Leal等采用TriMix无修饰mRNA策略治疗获得性免疫缺陷综合症（AIDS）患者，使用高剂量的TriMixmRNA进行的治疗表明，可以刺激和检测到较高的HIV特异性T细胞应答。这项研究证明了这种策略的高安全性和耐受性。
一些mRNA药物递送载体也具有佐剂作用，例如阳离子脂质和鱼精蛋白。年，研究人员使用了以阳离子脂质1,2-二油酰基-3三甲基铵丙烷/1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOTAP/DOPE）为佐剂的mRNA疫苗免疫策略，发现激活更多炎症细胞因子，且I型IFN的分泌也比对照DC中的mRNA高。在小鼠中皮下注射这种mRNA疫苗后，可以短暂地在淋巴结中检测到大量的I型IFN分泌和炎性单核细胞的快速聚集。这表明阳离子脂质可以在一定程度上增强mRNA疫苗的佐剂作用和功效。研究还表明，mRNA和鱼精蛋白复合物在涉及TLR7和TLR8的T-help1细胞（Th1）反应中扮演危险信号。由CureVac设计的RNActive?疫苗平台使用共同递送的RNA和鱼精蛋白复合物作为佐剂来诱导Th1T细胞反应，并使用裸露，未经修饰和序列优化的mRNA作为抗原来开发mRNA疫苗，在这个技术上，鱼精蛋白制成的RNA仅作为佐剂，而不作为mRNA载体，使更多的RNActive?疫苗能够在许多临床前模型中引起强烈的免疫反应，从而可以成功地预防各种流感毒株的袭击。Kowalczyk等揭示了RNActive?疫苗对小鼠的治疗可以通过皮内免疫来启动平衡而强烈的特异性免疫反应，这种免疫刺激仅存在于受刺激的部位和淋巴器官，血清中未检测到促炎因子。总体而言，RNActive?技术是一种具有高度安全性和灵活性的新型mRNA疫苗技术。
4．mRNA递送系统
mRNA需要进入宿主细胞质才能表达主要功能的特异性抗原。然而，mRNA分子还不够小，无法通过自由扩散穿过细胞膜。此外，mRNA和细胞膜均带负电荷，这增加了mRNA传递的难度。此外，存在皮肤和血液中的细胞外核糖核酸可轻易降解mRNA。因此，以足够高的翻译水平将mRNA传递到足够数量的细胞中是mRNA疫苗最困难的应用问题之一，因为它需要高度特异性和高效的mRNA传递系统。目前已经开发并应用了多种mRNA递送方法和mRNA递送载体（表1）。
表1mRNA传递系统的案例缩写：NSCLC，非小细胞肺癌；ZIKV，Zika病毒;AIDS，获得性免疫缺陷综合症；DC，树突状细胞；LNP，脂质纳米颗粒（可电离的阳离子脂质，PEG，胆固醇，磷脂）；PEG，聚乙二醇；DOTAP，二油酰基-3-三甲基铵丙烷；DOPE，二油酰基磷脂酰乙醇胺；DC-胆固醇，3β-[N-（N，N-二甲基氨基乙烷）氨基甲酰基];DOTMA，N-[1-（2，3-二油酰氧基）丙基]-N，N，三甲基氯化铵；PBAE，聚（β-氨基酯）;PSA，聚乙烯亚胺-硬脂酸；PEI，聚乙烯亚胺；DEAE，二乙氨基乙基；hPBAEs，超支化聚（β-氨基酯）；PEG[Glu（DET）]2，N-取代的聚乙二醇-二嵌段-聚谷氨酰胺；PLGA，聚（乳酸-乙醇酸共聚物）；CLAN，阳离子脂质辅助纳米粒子；BHEM-胆固醇，N-双（2-羟乙基）-N-甲基-N-（2-胆固醇酰氧基羰基氨基乙基）溴化铵。
4.1裸mRNA递送系统
4.1.1直接注射裸mRNA
早期研究表明，裸mRNA注射可引起小鼠的免疫反应。目前，mRNA的给药途径一般包括皮下注射，皮内注射，结节内注射，肌内注射，静脉注射，肿瘤内注射等，这些方式有助于刺激抗原呈递和启动免疫反应。年，Phua等发现皮下注射裸mRNA在小鼠中的递送效率甚至高于mRNA纳米颗粒的递送方法。VanLint等发现肿瘤内注射与肿瘤相关的mRNA将引起适度的免疫反应，并认为这可能是未来有希望的疫苗接种策略。现阶段裸mRNA的直接注射主要用于治疗或预防传染病。然而，即使注射裸mRNA可以引起免疫反应，这种递送方法的作用还是相对较弱的，并且注射后裸mRNA通常会迅速降解。裸mRNA的直接注射过于简单原始，无法在人类患者中应用，这种给药途径经常被用作与其他递送系统一起注射修饰的mRNA疫苗以达到更好的疫苗效果。
4.1.2裸mRNA的物理递送
借助电穿孔，基因枪，微针等常见物理方法，可以提高裸mRNA抗原呈递的效率。电穿孔可以提高mRNA的递送效率，而无需其他模式受体，这可以减少不必要的免疫反应。电穿孔还有辅助作用，可以募集促炎细胞并在接种部位诱导细胞因子的产生，从而提高mRNA的免疫原性。年，Callis等发现电穿孔可用于以低转染效率将mRNA转移到动植物细胞中，但靶细胞内产物表达水平足够检测。年，电穿孔法在DC中的mRNA转染效率已达到50-90％。基因枪法利用压缩氦气作为加速力，将包被在金颗粒表面的mRNA推入宿主细胞，是一种有效的mRNA传递方法。年，邱等使用基因枪方法将人α-1抗胰蛋白酶mRNA转入小鼠皮肤中并成功触发了抗体反应。北京大学开发了一种基于mRNA的遗传性皮肤病治疗方法，通过基因枪传递，mRNA被有效地递送到小鼠的目标皮肤层。尽管有进展，但基因枪方法却很少在大型动物和人类中使用。传递mRNA的物理方式可能会影响细胞的生理结构和活性，甚至导致细胞的异常死亡。因此，在人体中应用物理法传递mRNA具有潜在的危险性。
4.2DCs输送系统的体外装载
树突状细胞是免疫系统中最有效的抗原递呈细胞之一，可以通过主要的组织相容性复合物（MHC）将加工过的抗原呈递给CD4+，CD8+T细胞，从而触发细胞免疫。同时，DC也可以将完整的抗原呈递给B细胞，从而引发体液免疫。将DC用作mRNA传递载体的常用方法是通过体外将编码肽、蛋白质或其他抗原的mRNA转染到DC中，然后将加工后的DC转移回宿主体内以启动抗原特异性免疫反应。DCs-mRNA递送系统无需与其他载体分子结合，可以产生高输送效率，被广泛用于临床前实验，动物模型和临床研究。此外，由于主要引起细胞免疫应答，因此该策略主要应用于癌症治疗。但是，仅通过DCs的内吞作用，mRNA的转染率非常低，电穿孔法通常可进一步提高mRNA的转染率。盖伊等通过电穿孔将编码HIV抗原的mRNA转移到DC中进行HIV治疗，皮内注射后，HIV特异性CD28+/CD45RA-CD8+因子/细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的数量至少比对照高2倍，增强了HIV患者的T细胞免疫反应。体外装载的DCmRNA疫苗临床应用中另一个不可忽略的障碍是，耗时费钱的生产过程无法满足某些治疗方法对mRNA疫苗的大量需求。此外，在耗时的体外制备过程中，mRNA转染后数小时内引起的免疫反应可能会丢失，导致mRNA疫苗的治疗效果降低。基于这些考虑，短期内需大量mRNA疫苗治疗的疾病应优先选择能快速生产的递送系统。也可以考虑将mRNA直接靶向体内APC的递送系统。
4.3鱼精蛋白制成的递送系统
鱼精蛋白是具有树脂状结构的碱性阳离子蛋白。将mRNA与鱼精蛋白以不同的质量比结合可以产生具有不同直径的静电鱼精蛋白-mRNA复合颗粒，这种结合形式可以有效地保护mRNA免受血清RNase的降解，并且该复合物可以引起免疫细胞（如DC，单核细胞，B细胞，自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞）的强烈免疫反应。这表明鱼精蛋白不仅可以用作mRNA载体，而且还可以用作免疫激活剂。年，鱼精蛋白已被研究为长RNA的递送材料之一。Fotin-Mleczek在mRNA肿瘤疫苗接种过程中使用鱼精蛋白作为递送介质成功引发完全的特异性抗肿瘤反应。当鱼精蛋白与mRNA的质量比为1：2时，形成的静电复合物的大小约为nm，这是相对稳定的，可产生强大的免疫刺激作用和高细胞因子水平，但缺点是明显抑制蛋白质表达；当鱼精蛋白与mRNA的质量比为1：4时，与质量比1：2相比，蛋白质表达增加，但细胞因子水平降低。因此，初始的考虑是在鱼精蛋白配制的mRNA递送系统中mRNA翻译效率和免疫强度受到限制，且推测该缺陷可能与极紧密的静电复合物有关。近年来，鱼精蛋白mRNA递送系统已广泛用于临床并获得了很好的临床治疗效果，例如狂犬病，非小细胞肺癌等。仅使用鱼精蛋白-mRNA激活免疫反应的RNActive?疫苗平台是解决该问题的一种流行技术。此外，要同时使用鱼精蛋白作为mRNA传递和免疫激活剂，鱼精蛋白的结构优化或寻找与鱼精蛋白性质相似的蛋白质作为替代品值得我们
